O envelhecimento é um importante fator de risco para o desenvolvimento da síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) em pacientes que lutam contra infecções respiratórias virais e bacterianas. Na SDRA, a vasculatura pulmonar disfuncional e inflamada promove edema pulmonar grave e reduz a concentração de oxigênio, levando à morte prematura dos pacientes. Vários estudos mostraram que a perda ou disfunção de uma enzima importante para a homeostase da vasculatura, o óxido nítrico sintase endotelial (eNOS; NOS3), desempenha um papel fundamental durante o desenvolvimento da SDRA grave. A eNOS é uma importante fonte de NO endotelial, cujo efeito protetor no sistema cardiopulmonar já é conhecido e, quando desregulada, pode causar um dano tecidual significativo, principalmente pela produção de espécie reativa de oxigênio e aumento de genes pró-inflamatórios. Assim, levando em consideração a necessidade urgente de um melhor entendimento sobre o mecanismo molecular que causa a perda da integridade vascular pulmonar em pacientes idosos e a causa subjacente de sua resposta exacerbada a patógenos, nosso objetivo geral é determinar como o envelhecimento associado à função reduzida da eNOS contribui para o estresse oxidativo e perda da integridade vascular pulmonar. Além disso, levantamos a hipótese de que a função fisiológica reduzida da eNOS leva a um aumento compensatório na função da enzima NOS1 (nNOS), contribuindo para a inflamação associada ao envelhecimento e redução da sobrevivência em resposta à SDRA induzida por vírus/bactérias. (AU)

O Transtorno de Estresse Pós-Traumático (TEPT) é uma desordem psiquiátrica que pode se desenvolver por indivíduos vulneráveis após exposição a eventos traumáticos intensos. O tratamento para TEPT normalmente é realizado com inibidores seletivos da recaptação de serotonina (ISRS), antidepressivos tricíclicos e psicoterapia. Entretanto, como ainda existem diversos mecanismos não elucidados para entender esse transtorno, existe alta taxa de remissão. Diversas moléculas e importantes neurotransmissores no cérebro podem estar envolvidos nos mecanismos alterados no TEPT, incluindo no processamento do medo, como o Óxido Nítrico (NO). O NO é um neurotransmissor gasoso ligado à plasticidade sináptica e neuromodulação, e polimorfismos no sistema nitrérgico estão associados ao TEPT. Alterações na sinalização nitrérgica podem ser devido às enzimas de produção do NO, especialmente a enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e a enzima óxido nítrico sintase neuronal (nNOS). Essas enzimas, quando superexpressas em resposta ao estresse, por exemplo, podem desbalancear a homeostase; a exposição ao estresse possui um papel crucial no TEPT. Ademais, esses pacientes também apresentam alterações no Sistema Endocanabinoide, que é essencial para resposta do medo e ao estresse. O protocolo do Medo Condicionado Contextual (MCC), que é muito utilizado no estudo do TEPT, é baseado na formação, consolidação e evocação de novas memórias. Animais modificados geneticamente para não expressarem a enzima iNOS (iNOS KO) possuem déficits na memória de extinção devido à uma compensação da enzima nNOS, sendo assim, sugerimos o uso desses animais como um modelo genético para o TEPT. No projeto original, que está associado ao presente trabalho, a candidata administrou a droga Araquidonoil Serotonina (AA-5HT) - um antagonista seletivo do receptor receptores de potencial transitório vanilóide tipo 1 (TRPV1) e inibidor da enzima FAAH, que degrada anandamida (AEA) - nos animais iNOS KO para entender a relevância desses componentes para os déficits observados na consolidação da memória de extinção no MCC. O tratamento com AA-5HT, mas não a administração da mesma dosagem de SB366791 (SB - um antagonista seletivo do receptor TPRV1), ou URB957 (inibidor da enzima FAAH), facilitou a aquisição da memória de extinção e a evocação desta nos animais iNOS KO, sugerindo que ambos os mecanismos, bloqueio de TRPV1 e inibição da FAAH, são necessários para promover esses processos. Baseado nessa evidência e as ferramentas necessárias para posteriormente testar a ideia de que o sistema ECB está modulando comportamentos do tipo-TEPT, esse presente projeto propõe o uso de Vírus Adeno-associados (AAV) baseados em um vetor para promover a superexpressão do receptor CB1 ou a ferramenta shRNA (Small Hairpin RNAs) para promover a downregulação de FAAH ou TRPV1. Para validar essas ferramentas, propomos aplicar AAV e shRNAs em culturas de células neuronais e quantificar a expressão de componentes do sistema endocanabinoide presentes (CB1, FAAH, TRPV1). O supervisor estrangeiro, Dr. Florian Freudenberg, em seu laboratório na Universidade de Goethe de Frankfurt am Main, tem experiência extraordinária com a produção de ferramentas utilizando vetores virais, além de grande conhecimento em análises comportamentais. Com isso, esse projeto impactaria decisivamente na ainda precoce carreira da candidata, não apenas devido à importância da técnica aprendida, como também à oportunidade de firmar uma grande parceria com um laboratório renomado. Finalmente, de todo o nosso conhecimento, não existem grupos de pesquisa da nossa Universidade com essa experiência, conhecimento e tecnologia para realizar o desenvolvimento, empacotamento, amplificação e validação desses vetores virais, tornando essa experiência ainda mais singular. (AU)

O carcinoma hepatocelular é a terceira causa de morte em câncer, com baixa sobrevida e resistência à quimioterapia convencional, principalmente nos estágios intermediário e avançado. Nesse sentido, a nanomedicina tem se mostrado uma estratégia promissora para a superação da quimiorresistência e redução dos efeitos colaterais proporcionais. Nanopartículas de óxido de sílica (NPs de SiO2) e NPs de ZnO têm sido relatadas como nanopartículas interessantes para aplicações biomédicas, devido à sua baixa toxicidade e potencial para transportar fármacos. Essa estratégia também pode ser aliada à liberação exógena de óxido nítrico (NO), que é uma importante molécula sinalizadora endógena, recentemente relatada como um importante ator para superar a resistência quimioterápica. Assim, neste projeto pretendemos avaliar o efeito sinérgico de drogas quimioterápicas clássicas aliadas a NPs de SiO2 e NPs de ZnO liberadores de NO, previamente preparados no atual projeto de doutorado (2020/03646-2) e inibidores de tirosina quinase contra linhagens de células de câncer de fígado em diferentes estágios de diferenciação celular em células cultivadas 2D e 3D. Também pretendemos investigar os mecanismos de morte e o papel do NO na sensibilização de células tumorais resistentes a quimioterápicos. (AU)

A enterocolite necrosante (NEC) afeta 3 crianças por 1.000 nascidos vivos. É a emergência gastrointestinal mais comum no recém-nascido. Envolve uma lesão inicial no trato intestinal que acreditamos estar relacionada ao mau fluxo sanguíneo. À medida que a doença progride, os intestinos podem morrer e podem exigir a remoção cirúrgica. Estudos recentes sugeriram que a gravidade da NEC pode ser diminuída através do condicionamento isquêmico remoto (RIC). A terapêutica do RIC realizada em camundongos com NEC demonstrou que o bloqueio temporário dos vasos sanguíneos em uma área do corpo que torna os tecidos distantes resistentes aos danos causados pelo fluxo sanguíneo deficiente observado na NEC. O tratamento demonstrou aumentar a circulação sanguínea intestinal após o tratamento repetido e diminuição da lesão intestinal. Tais efeitos benéficos do RIC mostraram-se dependentes da dilatação dos vasos sanguíneos mediada pelo óxido nítrico (NO) que é uma molécula importante na fisiologia pulmonar por mediar a dilatação dos vasos sanguíneos e a oxigenação na circulação pulmonar e intestinal. O óxido nítrico inalado (iNO) é administrado a alguns neonatos com certos distúrbios respiratórios. Parte do iNO é absorvido pela circulação sanguínea. O objetivo deste estudo é avaliar se a quantidade de iNO absorvida na circulação é suficiente para impactar a perfusão intestinal e o conteúdo de oxigênio medido por espectroscopia abdominal próxima de infravermelho (NIRS). NIRS nos permite medir os níveis de oxigênio do sangue que vão para os intestinos. Nossa hipótese é que existe uma relação direta entre a concentração de iNO e a circulação sanguínea intestinal que pode ser medida por NIRS abdominal. O laboratório do Nationwide Children's Hospital tem muitos anos de experiência com o modelo de leitão. Para modelar a prematuridade do intestino do recém-nascido, o modelo de NEC em suíno, embora seja mais caro, é superior a outros modelos animais com sua similaridade na estrutura anatômica intestinal e tamanho do corpo equivalente a um bebê humano prematuro. (AU)

Neisseria gonorrhoeae é uma bactéria humana obrigatória responsável por causar gonorreia. Ela Infecta o epitélio da mucosa da uretra masculina e endo/ectocérvix feminina, causando mais de 87 milhões de casos por ano. Embora os antibióticos tenham tido sucesso no tratamento de infecções gonocócicas, N. gonorrhoeae desenvolveu multirresistência, estando entre as mais multirresistentes bactérias em circulação hoje em dia, e requer o desenvolvimento de novos tratamentos para superar esta problema. O óxido nítrico (NO) é um importante agente farmacêutico devido às suas propriedades terapêuticas, como os efeitos antimicrobianos, e é considerado um potente agente antibiótico contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. No entanto, as aplicações biomédicas do NO são limitadas por sua curta meia-vida e concentração precisa. Espécies doadoras de NO com maior estabilidade podem ser usadas para transportar e entregar NO em aplicações biomédicas. A fim de melhorar a entrega de NO e ajustar as propriedades farmacocinéticas, doadores de NO são geralmente incorporados em nanomateriais, resultando em nanoveículos capazes de realizarem a liberação de NO de uma maneira dose-controlável. Nanopartículas de sílica podem ser usadas como nanoveículos, considerando sua biocompatibilidade e porosidade, sendo capazes de fornecer uma ambiente químico quase constante para as substâncias carregadas e evitar desvios das substâncias. Além disso, a incorporação de doadores de NO em uma matriz de hidrogel biocompatível permite um maior tempo de residência do NO no local de administração. Neste contexto, os objetivos do projeto são avaliar os efeitos antibacterianos de nanopartículas de sílica liberadoras de NO e de um hidrogel de Pluronic liberador de NO contra N. gonorrhoeae, fazendo uma comparação com antibióticos normalmente empregados contra esse patógeno. (AU)

Câncer de mama triplo-negativo (TNBC) refere-se a um grupo de doenças altamente heterogêneas caracterizadas pela ausência de receptores hormonais (progesterona e estrogênio), bem como a expressão/amplificação da proteína HER2. Além disso, este subtipo molecular de câncer de mama possui uma quantidade considerável de uma subpopulação funcional heterogênea de células capazes de se auto-renovar, diferenciar e iniciar tumores. Essas células são denominadas Células-Tronco Tumorais (CSCs) e estudos têm mostrado que elas estão envolvidas na aquisição de resistência à terapia. Uma das vias de sinalização desreguladas nas CSCs é a via Cripto-1/NODAL, responsável por manter o fenótipo stemness dessas células. Além disso, estudos têm demonstrado que o óxido nítrico (NO) é capaz de induzir propriedades semelhantes à células-tronco em alguns tipos de câncer, incluindo TNBC. Assim, a modulação dos níveis de NO pode impactar a população de CSCs e ajudar a reverter e/ou evitar o desenvolvimento de características de stemness. Nesse sentido, sulforafano (SFN), um composto natural de isotiocianato encontrado principalmente em crucíferos como brócolis e couve-flor, tem demonstrado ser capaz de diminuir a atividade da NO sintase e consequentemente os níveis séricos desse radical livre em algumas situações patológicas, como a infecção por H. pylori. Portanto, o objetivo do presente estudo é investigar possíveis mecanismos NO-dependentes através dos quais SFN pode atuar na população CSCs de TNBC. (AU)

Nesse estudo, nanocompósitos formados por nanopartículas de gelatina/policaprolactona (Gelatina/PCL-NPs) carregados com os doadores de NO S-nitrosoglutationa (GSNO), hidrofílica e com a S-nitroso-N-acetilpenicilamina (SNAP), hidrofóbica, serão preparados com o objetivo de se obter uma formulação com perfil dual de liberação de NO: uma liberação rápida de NO pela GSNO, que estará presente na fase de gelatina, seguida de um perfil lento de liberação de NO pela SNAP que estará presente na fase de nanopartículas de poliéster. Espera-se que essa abordagem leve a formulações que permitam ajustar a taxa de liberação de NO desde que as que exigem altas taxas de liberação de NO (ex: para ação microbicida), até as que exigem baixas taxas de liberação de NO (ex: para promover cicatrização de feridas). Trabalhos anteriores do grupo da Profª Cecile Dreiss do Instituto de Ciências Farmacêuticas do King's College, Londres, Reino Unido, mostraram que nanocompósitos de gelatina/poli(hidroxibutirato) eram capazes de promover a liberação dual de um antioxidante e de um anti-inflamatório não esteroidal (AINE), oferecendo uma prova de conceito para a combinação de gelatina e nanopartículas de poliéster para esse propósito. No presente projeto PCL-NPs serão usadas como a fase de poliéster para a incorporação de SNAP e a gelatina será usada para a incorporação do doador de NO solúvel em água, GSNO. Os nanocompósitos serão caracterizados em relação às suas propriedades reológicas submetidos a diferentes condições de hidratação para simular seus comportamentos durante a absorção de fluídos biológicos após a aplicação, juntamente com a morfologia das PCL-NPs preparadas. O perfil de liberação de NO dessas formulações será posteriormente caracterizado por quimiluminescência no laboratório do Prof. Marcelo G. de Oliveira, após o retorno da estudante ao Brasil. (AU)

Recentemente, nanopartículas híbridas compostas de metais nobres e nanopartículas superparamagnéticas têm atraído a atenção da comunidade científica devido à versatilidade de nanomateriais com diferentes características e funções em uma única nanoestrutura. A combinação de nanopartículas de óxido de ferro superparamagnéticas (Fe3O4 NPs) com nanopartículas de prata (AgNPs) leva a formação das nanoestruturas híbridas de Fe3O4@Ag NPs com propriedades superparamagnéticas e antibacterianas, adequadas para aplicações biomédicas, como tratamento direcionado e transporte controlado de drogas, já que essas nanopartículas podem ser facilmente guiadas para o local alvo, aplicando um campo magnético externo. Além disso, a funcionalização superficial de Fe3O4@Ag NPs com quitosana (CS) pode melhorar a atividade antibacteriana das nanopartículas, bem como aumentar sua biocompatibilidade e dispersão em meio aquoso. O revestimento da superfície utilizando CS permite a incorporação de óxido nítrico (NO), reconhecido por importantes funções biológicas, incluindo ação antibacteriana. No entanto, as interações de nanopartículas com biomoléculas em fluidos biológicos, em particular nanopartículas híbridas, ainda devem ser investigadas. Em aplicações biomédicas, as nanopartículas podem ser administradas, por exemplo, por via dérmica, por ingestão ou por via de injeção, podendo atingir o sistema circulatório. Neste sentido, a compatibilidade sanguínea é um parâmetro importante que deve ser avaliado na fase pré-clínica da administração de nanopartículas. Neste projeto, a hemocompatibilidade das Fe3O4@Ag NPs, bem como das Fe3O4@Ag NPs doadoras de NO, será extensivamente estudada para verificar a hemocompatibilidade dessas nanopartículas. (AU)

A pré-eclâmpsia (PE) é uma síndrome específica da gestação, associada a disfunção endotelial, níveis séricos elevados de citocinas pró-inflamatórias e estresse oxidativo. Trabalhos anteriores de nosso grupo demonstraram que a PE é marcada por estresse oxidativo e que monócitos do sangue periférico materno parecem ser uma importante fonte de radicais livres e citocinas inflamatórias nessa doença. Óxido nítrico (NO) é um mediador biológico capaz de induzir a vasodilatação. O desbalanço entre NO e as espécies reativas de oxigênio (ROS) parece ter importante papel na patogênese da PE e pode ser amenizado através da administração de silibinina (SB), um flavonóide com propriedades antioxidantes. Portanto, esse projeto tem como objetivo avaliar se o sobrenadante de monócitos de gestantes normotensas e portadoras de PE cultivados na presença ou ausência de SB é capaz de modular a geração de estresse oxidativo e melhorar a disponibilidade de NO em células endoteliais humanas de veia umbilical (HUVEC). HUVECs serão cultivadas até alcançarem 80% de confluência e então serão incubadas por 24 em meio com 20% (vv) de sobrenandante de monócitos de gestantes normotensas ou portadoras de PE tratados ou não com silibinina. As células e o sobrenadante gerado serão usados para os ensaios. Electron paramagnetic resonance (EPR) e high performance liquid chromatograpgy (HPLC) serão utilizadas para dosar NO e seus metabólitos nitrito e nitrato. Determinação de Thiobarbituric acid reative substances (TBARS) será empregada para avaliar a peroxidação lipídica mediada por ROS. Concentrações de heme-oxigenase 1 (HO-1) serão mensuradas através de ensaios imunoenzimáticos (ELISA). As análises estatísticas serão realizadas empregando testes paramétricos ou não paramétricos, com significância e 0,05.

A pré-eclâmpsia (PE) é uma síndrome exclusiva da gestação humana que apresenta inicialmente disfunção placentária local e evolui para uma doença identificada por hipertensão e / ou proteinúria. O óxido nítrico (NO) é um mediador biológico com papel importante durante a gestação, representando o principal vasodilatador na placenta. Distúrbios no sistema NO são responsáveis pela disfunção endotelial vascular presente na PE e juntamente com a produção em excesso de espécies reativas de oxigênio (EROs), pode explicar a má perfusão placentária na PE. O objetivo deste estudo é avaliar se as células endoteliais humanas (HUVEC) cultivadas com sobrenadante de explantes placentários de grávidas normotensas (NT) e pré-eclâmpticas com vitamina D apresentam diminuição do estresse oxidativo e aumento da biodisponibilidade do NO. A linhagem de células endoteliais será cultivada até atingir 80% de confluênciae depois incubada por 4 e 24 horas em meio com 20% (v / v) de sobrenadante de explantes placentários cultivados com ou sem peróxido de hidrogênio (H2O2) e vitamina D (VD).As células e o sobrenadante serão utilizados para realizar os ensaios. Ressonância paramagnética eletrônica (EPR) e sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) serão usados para avaliar o NO e seus metabólitos oxidados, nitrato e nitrito, mas também EROs específicas. A determinação de TBARS (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico) será empregada para avaliar a peroxidação lipídica mediada por EROs, assim como dimetilarginina assimétrica (ADMA). Citocinas incluindo IL-1², IL-18, TNF-±, IL-10 e caspase-1 serão avaliadas pelo ensaio ELISA Multiplex. A análise estatística (ANOVA ou teste t) será realizada empregando testes paramétricos ou não paramétricos, com valor de p <0,05 considerado significativo.